背景：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation Kit Ⅲ(for N-Linked & Complex O-Linked Glycans)包含去除所有N-连和部分复杂O-连聚糖所需要的酶及试剂。其中的酶试剂是五种糖苷酶的混合物，包括PNGase F、O-Glycosidase、α2-3.6.8.9Neuraminidase 、β1-4 Galactosidase及β-N-Acetylhexosaminisase。该试剂盒包含的所有酶及试剂均与下游HPLC及MS兼容。PNGase F是从糖蛋白中特异性除去N-连聚糖的糖苷内切酶，能够将绝大多数N-连聚糖（除最内测GlcNac上连有α-1,3岩藻糖残基，常见于植物及昆虫糖蛋白）完整地从其所连接的蛋白分子上释放下来，可以在N-连糖肽或糖蛋白的高甘露糖、杂合和复杂寡糖部分最内侧的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基（Asn）之间进行切割，释放出完整的寡糖链，如图1。

图1. PNGase F可以从糖蛋白或糖肽上切割释放几乎所有类型的N-连糖链

       但是对于O-连聚糖，由于结构复杂多样且数量更多，其需要一系列糖苷酶组合使用从糖链末端逐一切除修饰的单糖，α2-3.6.8.9 Neuraminidase释放所有直链或支链非还原末端的唾液酸残基，β1-4 Galactosidase水解寡糖链上的β1-4连接的半乳糖残基，β-N-Acetylhexosaminisase催化聚糖末端β-D-N-乙酰半乳糖胺和葡萄糖胺残基的水解，直到将O-连聚糖修剪成Core 1（Gal-GalNAc-O-S / T）或/和Core 3（GlcNAc-GalNAc-O-S / T）结构，然后O-Glycosidase才能酶切释放Gal-GalNAc或/和GlcNAc-GalNAc核心二糖结构，如图2。此五种酶的组合不能酶切释放所有的O-连聚糖，如罕见的α-连接的半乳糖、α-连接的岩藻糖、直接与蛋白质O-连接的N-乙酰葡萄糖胺（在核蛋白质上发现）、直接与蛋白质α-连接的N-乙酰半乳糖胺（在粘蛋白中发现）、直接与蛋白质O-连接的岩藻糖及甘露糖等。

图2. O-连糖链的释放需要通过一系列糖苷酶除去单糖，直到将它们修剪成Core 1（Gal-GalNAc-O-S / T）或/和Core 3（GlcNAc-GalNAc-O-S / T）结构

包装规格：

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation Kit Ⅲ (for N-Linked & Complex O-Linked Glycans)包装规格如下：

配套试剂： 

       Rhinogen^® Protein Deglycosylation Kit Ⅲ (for N-Linked & Complex O-Linked Glycans)配套提供的试剂如下：

产品来源：

       本试剂盒中的所有酶都是大肠杆菌BL21中表达并分离纯化的重组酶：PNGase F 基因来源于Flavobacterium meningsepticum，分子量为36kDa；O-Glycosidase基因来源于Enterococcus Faecalis，分子量为147kDa；α2-3,6,8,9 Neuraminidase 基因来源于Arthrobacter ureafaciens，分子量为66KDa；β1-4 Galactosidase基因来源于Streptococcus pneumoniae，分子量为94kDa；β-N-Acetylhexosaminisasef 基因来源于Streptomyces plicatus，分子量为55kDa。

产品质量：

       SDS-PAGE分析，纯度≥95%；没有检测到污染的糖苷外切酶、糖苷内切酶及蛋白酶活性。

储存条件：

       采用冰袋运输，收到产品后请立即将酶置于4℃，严禁冻存；配套试剂置于-20℃储存。本品不含防腐剂，务必确保无菌操作取用，避免污染。

应用：

       1. 聚糖结构分析；

       2. 结合位点及功能分析；

       3. 治疗性糖蛋白的表征及质量控制；

       4. 蛋白质组学分析，消除糖蛋白的异质性。

使用建议：

       变性条件下去糖基化方案：

       1. 取10-100µg糖蛋白溶液，加入3µl 10×Denaturing缓冲液，补加纯化水使得反应体系为30µl；

       2. 将上述30µl体系100℃处理10min，使糖蛋白完全变性；

       3. 室温冷却5min；

       4. 在上述变性体系中，分别加入5µl 10×Glyco缓冲液2、5µl 10% NP-40溶液、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase、β1-4 Galactosidase及β-N-Acetylhexosaminisase，补加纯化水至反应总体积为50μl，轻柔混匀；

       5. 37°C 条件下反应1-5hr；

       注意：大多数糖蛋白样品在37°C 条件下反应1-5hr后能够被完全去糖基化；然而对于一些复杂的糖蛋白样品可能需要更长的反应时间。

       非变性条件下去糖基化方案：

       1. 取10-100µg糖蛋白溶液，加入5μl 10×Glyco缓冲液2、1-2μl PNGase F(Glycerol-free)、1-2μl O-Glycosidase、1-2μl α2-3.6.8.9Neuraminidase、1-2μl β1-4 Galactosidase及β-N-Acetylhexosaminisase，补加纯化水至反应总体积为50μl，轻柔混匀；

       2. 37°C 条件下反应4-24hr；

       注意：当对天然糖蛋白去糖基化时，建议将等量糖蛋白样品进行变性后再同步进行酶切去糖基化实验，作为阳性对照，以确定非变性条件下去糖基化反应的程度。

操作说明：

       1. 上述操作方法旨在为Rhinogen^® Protein Deglycosylation Kit Ⅲ 作为去糖基化试剂操作的一般指南，对于不同的糖蛋白样品，去糖基化活性高度依赖于反应条件，建议进行适当优化或根据经验确定最优的操作方法；

       2. 反应体系可以线性放大或缩小；

       3. 本产品适用于天然或者变性糖蛋白，当变性时，大多数糖蛋白能更有效地去糖基化。对于天然糖蛋白的去糖基化，可能需要更多的酶及更长的反应时间；

       4. 变性及非变性条件下的去糖基化处理方案得到的样品均与下游质谱兼容；

       5. Fetuin可用作有效的阳性对照。试剂盒提供的Fetuin浓度为10mg/ml；

       6. 本试剂盒不建议用于粘蛋白样底物（Mucin-like substrates）的去糖基化；

       7. 本产品仅供研究使用，不适用于人或动物诊断或治疗用途。