介 绍  

在制药和医疗器械生产过程中，对污染物样品的监测是一个关键步骤。内毒素存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁中，是一种常见的污染物，可引起发烧、炎症、头痛、恶心，甚至死亡。

内毒素的常规检测方法是鲎试剂溶酶法（LAL），核心成分由鲎的血液中提取而来。在内毒素存在的情况下，LAL 通过酶促级联凝固，可以通过比浊法或显色法定量（图 1 A）。这些方法涉及多个酶的步骤，并受限于鲎资源的多少。

2021 年 2 月 5 日，国家林业和草原局、农业农村部发布公告，调整后的«国家重点保护野生动物名录»正式发布，将我国分布的鲎科动物（中国鲎、圆尾蝎鲎）升级为国家二级保护动物。

中国药典 2020 年版 9251 细菌内毒素检查法应用指导原则中指出，目前新的细菌内毒素检测方法不断出现，以适应特殊品种细菌内毒素检查的需要，或减少鲎试剂的使用量。如重组 C 因子法（见附）、微量凝胶法等。

图 1 酶促级联反应 LAL（A）和重组 C 因子 rFC 分析（B）。rFC 分析包括一个一步的酶联反应，消除了对鲎的需要，同时避免葡聚糖引起的 G 因子非特异性干扰造成的假阳性。

图 2 当葡聚糖存在时，LAL 显色法和 rFC 法反应特异性比较。

① 取用 4 支一次性无热原安瓿瓶，在瓶身标明内毒素工作标准品溶液浓度（分别 0.005、0.05、0.5及5EU/ml），用溶解至 20EU/ml 的内毒素工作标准品溶液制备系列内毒素标准品溶液。

② 提前将微孔板读板机的温度设置为37℃待用。将 100μl 阴性对照（无热原水）、内毒素工作标准品溶液、样品（两组）分别加入到 96 孔无菌无热原白板相应孔中，两复孔。两组样品中分别加入 10μl 0.5EU/ml 的内毒素工作标准品溶液作为加标样品组。加样后的 96 孔板在 37°C ± 1°C 的微孔板读板机中，预热 10-20 分钟。

③ 微孔板预热时，配置底物试剂。按照 5:4:1 的比例混合荧光底物溶液、测定缓冲液和 rFC 酶溶液，轻轻地充分混合，切勿漩涡混合。

④ 设置读板参数：

激发/发射波长设置为 380/440nm，PMT Gain 设置成 Automatic，顶读。以 i3x 为例，酶标仪读板设置如下图所示。

取出预热的 96 孔板，向所有样品孔中加入 100μl/ 孔底物试剂。

读取 0h 的相对应荧光强度 T0，将微孔板继续 37°C ± 1°C 孵育 1h，读取 1h 的相对荧光强度 T1。

⑤ 数据分析：

以内毒素工作标准品溶液浓度为横坐标，净 ΔRFU 为纵坐标绘图并进行 Log-Log 拟合，log(ΔRFU) = A*log(内毒素浓度 EU/ml)+B

说明：

所有孔的 ΔRFU=T1-T0

标准品/样品的净 ΔRFU= 标准品/样品的ΔRFU-阴性对照 ΔRFU

   结 果  

Molecular Devices 的 4 款微孔板读板机，SpectraMax M2e、SpectraMax M5e、SpectraMax iD3 和 SpectraMax i3x 均符合重组 C 因子试剂盒检测要求。我们已根据Rhinogen^® 重组 C 因子内毒素检测试剂盒的说明书编辑了统一的模板，直接调用模板即可读数。

标准曲线以内毒素工作标准品溶液浓度为横坐标，净 ΔRFU 为纵坐标绘图并进行 Log-Log 拟合。标准品有 5 个梯度（0，0.005 EU/ml，0.05 EU/ml，0.5 EU/ml，5EU/ml），每个样品 2 复孔。所有 4 款型号仪器的 R² 值都在 0.998以上，加标回收率也都在中国药典 2020 版要求以内。具体数据如下，

图 3 SpectraMax M2e， 标准曲线 R² 值 0.999

图 4 SpectraMax M5e ，标准曲线 R² 值 0.999，两个样品加标回收率分别为 110% 和 120%

图 5 SpectraMax iD3，标准曲线 R² 值 0.998，两个样品加标回收率分别为 82% 和 98%

图 6 SpectraMax i3x，标准曲线 R² 值 1.000，两个样品加标回收率分别为 102% 和 113%