细胞活性是指样本群体中健康细胞所占的比例,受培养参数改变、药物、生长因子及各种疾病因素影响。例如,癌细胞活性增强,引起细胞异常增殖、逃避细胞凋亡;神经退行性疾病和其他组织退行性疾病则表现为程序性细胞死亡;损伤和感染也会对细胞存活产生负面影响, 因此细胞活性检测对于确认细胞生理状态是必须的。
目前已经开发用于不同实验平台的多种细胞活性检测技术。通常根据检测原理可分为基于质膜完整性和基于代谢(如ATP代谢和线粒体NADH)的检测方法。
台盼蓝,也称二胺蓝(Diamine Blue)和加拉蓝(Niagra Blue), 是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染料之一。活细胞细胞膜结构完整,能够排斥台盼蓝,细胞不被染色;通常认为如果细胞膜丧失完整性,即是死细胞。死细胞的胞膜不完整,通透性增加,台盼蓝可渗入并将细胞染成蓝色。由此可以简单、快速地区分活细胞和死细胞。值得注意的是,如果长时间染色,台盼蓝可通过胞吞或胞饮作用进入细胞。因此染色时间不宜太长, 3~5分钟即可,否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色,使检测结果偏低。
当两种染料均存在于细胞核内,在合适的吖啶橙、碘化丙啶配比下,两种染料发生能量共振转移,死细胞在绿色通道下激发出红色荧光。由于吖啶橙和碘化丙啶为DNA结合染料,因此可有效排除杂质以及红细胞的干扰,确保对样品进行准确计数。
羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料,CFSE进入细胞后,可以不可逆地与细胞内的氨基结合,偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时,CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。在一个增殖的细胞群中,各连续代细胞的荧光强度呈对半递减,利用流式细胞仪在488nm激发波长和516nm检测波长进行分析。常用于淋巴细胞的增殖检测,也可以用于成纤维细胞、NK细胞等其它细胞的增殖检测,甚至还可以用于细菌增殖的检测。
MTT比色法,是一种可用于检测细胞活力的代谢性检测方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(SDH)能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收光值,可间接反映活细胞数量。
MTT法是较早且较为经典的方法。但由于MTT法形成的甲瓒是非水溶性的,需要加有机溶剂溶解,这不仅增加了研究人员的工作量,也给实验带来了一定的误差。一种升级的检测方法出现了Cell Counting Kit-8,简称CCK-8。
CCK-8细胞活性检测试剂中含有WST-8,一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以为线粒体内的脱氢酶验明正身。在脱氢酶作用下,WST-8被还原生成橙黄色的甲瓒产物,用酶标仪在OD 450nm波长处测定其光吸收值。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
CCK-8操作比MTT要简单,生成的有色物质是橙黄色、可溶于水,在显色后可直接比色。加入CCK-8后的细胞液仍可以继续培养细胞,对细胞毒性相对较小。CCK-8法虽说是MTT法的完美升级版,但是CCK-8试剂的颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色接近,在检测时容易漏加或多加。