报告基因法是将报告基因编码的序列与基因表达序列融合或者与其他目的基因融合形成重组蛋白，通过报告基因产物的表达来显示目的基因的表达调控。

基于荧光素酶的报告基因与β-半乳糖苷酶 (β-Gal)、葡萄糖醛酸酶 (GUS) 、绿色荧光蛋白 (GFP) 、分泌型碱性磷酸酶 (SEAP) 报告基因具有独特的优势，它的优势在于：

② 内源性低，哺乳动物无内源性表达和其检测不受细胞内其他物质影响的特点；

③ 无激发光的非特异性干扰，信噪比较高；

④ 检测范围广，大于7个数量级。

图1。(A)，I型干扰素在用ISRE驱动的荧光素酶稳定转染的HEK 293细胞中诱导荧光素酶表达。(B)，抗-IL-6/抗-IL-6R mAbs抑制用SIE驱动的荧光素酶稳定转染的DS-1细胞中IL-6诱导的荧光素酶表达。(C)，抗VEGF/抗VEGFR2 mAb抑制用VEGFR2和NFAT响应性荧光素酶稳定转染的HEK 293细胞中荧光素酶的表达。(D)，CHO细胞被膜锚定的抗CD3 scFv和PD-L1稳定转染，而Jurkat细胞被PD-1和NFAT反应性荧光素酶稳定转染。CHO细胞上的抗 CD3 scFv交联并激活Jurkat细胞上的CD3，导致NFAT控制的荧光素酶的表达，但CHO细胞上的PD-L1与Jurkat细胞上的PD-1相互作用，抑制荧光素酶的表达，而抗PD-1/anti-PD-L1 mAbs阻断PD-1和PD-L1相互作用，导致荧光素酶表达抑制的逆转。(E)，Jukat细胞用FcγRIIIa-FcεRIγ嵌合体和用于mAb的ADCC的NFAT响应荧光素酶稳定转染。肿瘤抗原之间的相互作用mAbs和Fab以及mAbs的Fc和嵌合体的胞外FcγRIIIa部分有助于嵌合体的交联，由嵌合体的胞内FcεRIγ部分介导的信号转导导致NAFT控制的荧光素酶的表达。(F)，H322细胞用与荧光素酶C端融合的Shc蛋白和与荧光素酶N端融合的Grb2蛋白稳定转染用于抗EGFR mAb。由EGF诱导的EGFR的激活、二聚化和磷酸化依次募集Shc和Grb2，并且这两种蛋白质的接近重构了荧光素酶，而抗EGFR mAbs消除了由EGF诱导的荧光素酶生物活性。

下面简单介绍报告基因法检测抗HER2单克隆抗体ADCC生物学活性的方法构建。

构建FcγRⅢ表达质粒pcDNA3.1-hFcγRⅢa和报告基因质粒pcDNA3.1-NFAT-RE-luc，并转染Jurkat细胞，接种密度为2.5×10⁵～4×10⁵个·mL^-1，2～3d传代，最高细胞密度不应超过2×10⁶个·mL^-1；传代培养基为RPMI 1640+10%FBS。电转参数如下：电转体积为100μL；细胞数目为2×10⁶个·mL^-1；质粒用量为10μg；电转条件为1350V，10ms，3次。电转后的Jurkat细胞于6孔板培养，每孔培养基为2mL。

• 效应细胞株的筛选

转染24h或48h后加入筛选压力，以G418作为单转pcDNA3.1-hFcγRⅢa的选择压力剂，筛选质量浓度为500μg·mL^-1；以嘌呤霉素作为单转pcDNA3.1-NFAT-RE-luc的选择压力剂，筛选质量浓度为1.0μg·mL^-1；对于细胞表面的hFcγRⅢa分子，采用流式分析的方法进行克隆鉴定和筛选。200g离心5min收集1×10⁵个细胞，以PBS洗涤1次，200g离心5min后，加入1μg·mL^-1FITC标记remicade，4℃孵育1h，再以PBS洗涤3次，每次200g离心5min，最后以200μL PBS重悬细胞进行流式检测。通过NFAT通路激活因子PMA和离子霉素共刺激的方法检测NFAT-RE-luc报告基因信号高的克隆，不同克隆每孔加入200μL含有0.1μmol·L^-1PMA和1μmol·L^-1离子霉素的细胞培养基(含10%FBS的RPMI 1640培养基)刺激过夜，以仅加200μL细胞培养基的细胞孔作为阴性对照进行荧光信号比较筛选。

• 靶细胞的选择 

流式细胞术检测人乳腺癌细胞系SKBR3、BT474及MCF7表面HER2表达量差异，经FlowJo7.2.5软件分析可知，这3株细胞表面HER2蛋白的表达量高低为SKBR3>BT474>MCF7。ADCC试验成功的重要条件之一就是特异的HER2+靶细胞，在这几个HER2+细胞株中，SKBR3和BT474表面均高表达HER2抗原，明显优于MCF7。

• 抗体浓度范围选择、效靶比的选择、诱导时间的选择

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基于保证剂量效应四参数曲线平台及保证诱导效果的考虑，最终选择起始稀释工作浓度为4000ng·mL^-1，1∶4梯度稀释作为检测抗HER2单抗ADCC生物学活性时的试验方案。从不同效靶比得到的不同ADCC试验FI值并结合考虑EC50值，效靶比为15∶1时能有效诱导ADCC活性并得到最大的FI值。ADCC诱导倍数随着不同诱导时间变化明显，当诱导时间为20和24h时可得到较大诱导倍数，考虑到工作效率等因素，选择诱导时间为20h。

• 方法应用

以原研HER2单抗为参比品，选取不同类型的抗HER2单抗1、单抗2，运用选定的报告基因法，分别进行ADCC活性测定。单抗1作用于HER2胞外的第2个结构域，主要通过阻断HER2的二聚化发挥其抗肿瘤效应。单抗2是针对HER2靶点的新型抗体-药物偶联物(antibody drug conjugates,ADC)，其不仅具有原研抗HER2单抗类似的生物学活性，还能通过其偶联的化学药物的释放特异性地杀伤肿瘤细胞。从实验结果看出，不同类型的HER2单抗在本实验中均呈现较好的剂量效应曲线，说明本方法可应用于不同类型HER2靶点单抗ADCC效应的检测与比较。

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参考文献